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威斯騰生物經(jīng)過(guò)10多年的發(fā)展，獲得了上百種細(xì)胞株和四十余種原代細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)，并建立了龐大的細(xì)胞庫(kù)及原代培養(yǎng)資料庫(kù)。細(xì)胞平臺(tái)有資深實(shí)驗(yàn)員、規(guī)范的SOP操作文件，萬(wàn)級(jí)凈化細(xì)胞房，這些條件為保質(zhì)保量完成每個(gè)客戶的實(shí)驗(yàn)提供了保障。 同時(shí)，威斯騰生物結(jié)合多年原代及傳代細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合平臺(tái)已有的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，建立了完善的體外藥篩實(shí)驗(yàn)，并引進(jìn)RTCA(Real-time cellular Analysis，實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞記錄儀），在藥篩過(guò)程中，全程實(shí)時(shí)記錄細(xì)胞真實(shí)狀況，為藥篩提供最真實(shí)精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

無(wú)菌操作注意事項(xiàng)

細(xì)胞培養(yǎng)一定要保持工作區(qū)的無(wú)菌清潔，先用紫外燈和臭氧殺菌1h，然后通風(fēng)30min，操作前需要換細(xì)胞間專用拖鞋，雙手帶上一次性橡膠手套并用75%乙醇消毒，穿上實(shí)驗(yàn)服，戴上一次性口罩和帽子，操作時(shí)不能大聲說(shuō)話，整個(gè)無(wú)菌操作都應(yīng)該在酒精燈的周圍進(jìn)行。

小鼠巨噬細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)

培養(yǎng)板的包被

（1）將蓋玻片裁成 0.5cm×0.5cm 大小，洗滌劑浸洗、烘干。

（2）經(jīng) 5%鹽酸浸泡30min，自來(lái)水沖洗20min，三蒸水沖洗，浸泡過(guò)夜并烘干；移入 95%酒精浸泡保存。用前酒精燈烤干，放入 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板。

（3）用 0.01%的 L-多聚賴氨酸溶液包被培養(yǎng)皿和小玻片，37℃恒溫孵育 4h 或常溫過(guò)夜。

吸棄 L-多聚賴氨酸溶液，滅菌去離子水漂洗培養(yǎng)孔及小玻片，晾干備用。

小鼠巨噬細(xì)胞的分離及培養(yǎng)

(1) 實(shí)驗(yàn)開始前向小鼠腹腔注射0.5ml含40μg刀豆球蛋白a的磷酸鹽緩沖液（PBS）。

(2) 3天后，斷頸處死小鼠，75%酒精消毒小鼠皮膚。

(3) 置動(dòng)物于解剖臺(tái)上，用針頭固定四肢，雙手持鑷撕開皮膚拉向兩側(cè)，暴露出腹膜，但勿傷及腹膜壁。

(4) 再用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml 無(wú)菌PBS液注入腹腔中，同時(shí)從兩側(cè)用手指揉壓腹膜壁，令液體在腹腔內(nèi)充分流動(dòng)。

(5) 用針頭輕輕挑起腹壁，使動(dòng)物體微傾向一側(cè)，使腹腔中液體集于針頭下吸取入針管內(nèi)。

(6) 小心拔出針頭，把液體注入離心管中，1000r/min 4℃離心10分鐘，棄去上清液，重復(fù)兩次，加入完全培養(yǎng)液重懸。

(7) 將濾液進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn),血細(xì)胞計(jì)數(shù)板鏡下計(jì)數(shù)。以 8.0 ×104至 1.0 ×105/mL的密度將細(xì)胞以 400μl/孔接種到預(yù)先用L-多聚賴氨酸包被的24 孔培養(yǎng)板或 100μl/孔接種 96 孔培養(yǎng)板。

(8) 用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)24-48 h直到融合。

小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)

培養(yǎng)板的包被

（1）將蓋玻片裁成 0.5cm×0.5cm 大小，浸洗、烘干。

（2）經(jīng) 5%鹽酸浸泡30min，自來(lái)水沖洗20min，三蒸水沖洗，浸泡過(guò)夜并烘干；移入 95%酒精浸泡保存。用前酒精燈烤干，放入 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板。

（3）用 0.01%的 L-多聚賴氨酸溶液包被培養(yǎng)皿和小玻片，37℃恒溫孵育 4h 或常溫過(guò)夜。

去除 L-多聚賴氨酸溶液，滅菌去離子水漂洗培養(yǎng)孔及小玻片，晾干備用。

小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的混合培養(yǎng)

(1) 75%（體積分?jǐn)?shù)）酒精消毒新生 24h 內(nèi)的清潔級(jí)小鼠，在無(wú)菌條件下斷頭，剪開頭皮及顱骨，取出腦組織，置于盛冷的pH7.2,無(wú)鈣、鎂的D-Hank's液的平皿中（下置冰袋）。

(2) 無(wú)菌剝離腦組織，除去小腦、海馬、大腦髓質(zhì),分離大腦皮層，仔細(xì)剝離腦膜及血管。

(3) 用虹膜剪將組織剪切成 1mm3左右的組織塊，0.125%胰蛋白酶消化，37℃作用 20min，期間振搖 2～3 次。

（4）棄去上清液，加入完全接種液終止消化，漂洗兩次。巴斯德吸管輕輕吹打至肉眼觀察無(wú)明顯的腦組織團(tuán)塊，靜置 2min。

（5）懸液收集于新的離心管，離心（1000r/min，10 min，4℃），棄去上清液。加入完全培養(yǎng)液重懸，200 目不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要接種于若干個(gè)25cm細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中。

（6）置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后更換一次培養(yǎng)基，以后每3d換一次液，并在鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活情況。

小膠質(zhì)細(xì)胞的分離和純化

（1）細(xì)胞培養(yǎng)14～16d左右,在倒置相差顯微鏡下可觀察到混和膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物中出現(xiàn)細(xì)胞分層現(xiàn)象, 即底層為扁平、多種形狀的、具有多個(gè)突起的星型膠質(zhì)細(xì)胞,小膠質(zhì)細(xì)胞明顯偏小呈類圓形、折光性強(qiáng),附著于星型膠質(zhì)細(xì)胞表面生長(zhǎng)。

2）倒掉培養(yǎng)液,用0.05%胰酶2～3mL消化,邊觀察邊輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶,等到貼附在星形膠質(zhì)細(xì)胞上的小膠質(zhì)細(xì)胞脫離下來(lái),將含漂浮的小膠質(zhì)細(xì)胞的消化液轉(zhuǎn)入10mL離心管，立刻用完全培養(yǎng)基終止消化。

（3）離心管配平,1000r/min, 離心5min, 棄上清；加定量完全培養(yǎng)再次吹打成細(xì)胞懸液,接種于預(yù)先包被的置有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板,置于CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(37度)培養(yǎng)。

（4）生長(zhǎng)24h后吸掉培養(yǎng)液,以去除未貼壁的少突膠質(zhì)細(xì)胞,加完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

大鼠肝細(xì)胞原代分離培養(yǎng)

（1）麻醉及灌流：將大鼠以7%水合氯醛（0.5ml/100g）麻醉，75%乙醇消毒后移至工作臺(tái)，0.45mm頭皮針連接蠕動(dòng)泵，打開蠕動(dòng)泵，調(diào)整蠕動(dòng)泵灌流速度為7ml/min，抽取37℃預(yù)熱的灌流液I并排空裝置內(nèi)的空氣。打開腹腔，將胃腸結(jié)構(gòu)推向左腹上側(cè)，分離出下腔靜脈（腎上段）、肝門靜脈，剪開隔膜，動(dòng)脈夾夾閉下腔靜脈肝上段，將頭皮針插入下腔靜脈（腎上段），動(dòng)脈夾夾閉固定，打開蠕動(dòng)泵，灌注37℃預(yù)熱的灌流液I，確定肝臟均勻膨脹后剪開肝門靜脈，繼續(xù)灌流至肝臟變成土黃色且肝門靜脈剪斷處流出無(wú)色灌流液為止，更換預(yù)先預(yù)熱的37℃灌流液II，直至肝臟表面出現(xiàn)白色裂紋時(shí)停止灌流。剪下肝臟，置于無(wú)菌D-Hanks溶液中。

（2）肝細(xì)胞的收集：將肝臟在PBS溶液中洗2次，然后放入高糖DMEM培養(yǎng)基中，眼科鑷撕開肝包膜，此時(shí)肝細(xì)胞會(huì)分散在培養(yǎng)基中，然后用200目不銹鋼細(xì)胞篩過(guò)濾，將濾液轉(zhuǎn)移至15ml無(wú)菌離心管。

（3）肝細(xì)胞純化：將收集的濾液以800rpm離心5min，棄去上清，用高糖DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，用200目不銹鋼細(xì)胞篩再次過(guò)濾，離心收集細(xì)胞沉淀。用高糖DMEM肝細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。
（4）肝細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力檢測(cè)：取0.1ml肝細(xì)胞懸液與0.1ml PBS、0.1 ml40g/l的臺(tái)盼藍(lán)儲(chǔ)備液混合后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)收獲的肝細(xì)胞總量及存活率。
（5）將肝細(xì)胞懸液調(diào)整細(xì)胞5x105/ml接種于鋪有鼠尾膠原的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后換液，用高糖DMEM肝細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。后續(xù)隔天換液培養(yǎng)。

威斯騰生物服務(wù)流程

威斯騰生物服務(wù)項(xiàng)目

細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)	高通量測(cè)序	代謝組學(xué)
細(xì)胞原代培養(yǎng)	mRNA測(cè)序	氣相色譜GC/MS
MTT檢測(cè)	LncRNA測(cè)序	液相色譜LC/MS
細(xì)胞凋亡檢測(cè)	全基因組測(cè)序	核磁共震NMR
細(xì)胞周期檢測(cè)	RNA-Seq測(cè)序
細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)	外顯子測(cè)序	影像學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)
Transwell細(xì)胞遷移/侵襲	16s擴(kuò)增子測(cè)序	Micro-CT
流式分選	Small RNA測(cè)序	小動(dòng)物活體成像
CCK8/XTT檢測(cè)	宏基因組測(cè)序	核磁共振
臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活性	單細(xì)胞測(cè)序	PET-CT
藥物篩選細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)	circleRNA測(cè)序
細(xì)胞粘附性檢測(cè)	甲基化測(cè)序	基因編輯動(dòng)物
細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)		條件性敲除小鼠/大鼠
細(xì)胞生物學(xué)整體實(shí)驗(yàn)		全基因敲除小鼠/大鼠
細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)
病理檢測(cè)	CRISPR/Cas9細(xì)胞敲除/敲入	基因芯片
掃描電鏡	基因定點(diǎn)突變細(xì)胞系	LncRNA芯片
透射電鏡	單基因敲除細(xì)胞系	miRNA芯片
HE染色	多基因敲除細(xì)胞系	mRNA芯片
免疫組化	目的基因敲入細(xì)胞系	甲基化芯片（限人和小鼠來(lái)源樣本）
Tunel（原位末端凋亡法）檢測(cè)	報(bào)告基因敲入細(xì)胞系	SNP芯片（限人和小鼠來(lái)源樣本）
激光共聚焦	miRNA/LncRNA敲除細(xì)胞系
免疫熒光
Masson染色	CRISPR/Cas9動(dòng)物敲除/敲入
原位雜交	基因敲除大鼠/小鼠
熒光原位雜交	基因敲入大鼠/小鼠
特殊染色（PSA、茜素紅、阿爾新藍(lán)等）
行為學(xué)檢測(cè)	藥物篩選服務(wù)項(xiàng)目	藥效學(xué)評(píng)價(jià)
曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)	高通量自動(dòng)藥物篩選平臺(tái)	抗腫瘤藥物藥效學(xué)評(píng)價(jià)
重復(fù)性刻板行為檢測(cè)	細(xì)胞高內(nèi)涵藥物篩選平臺(tái)	心血管系統(tǒng)藥物藥效學(xué)評(píng)價(jià)
動(dòng)物跑臺(tái)檢測(cè)	蛋白質(zhì)組學(xué)靶標(biāo)研發(fā)平臺(tái)	泌尿系統(tǒng)藥物藥效學(xué)評(píng)價(jià)
強(qiáng)迫游泳	分子藥理研究平臺(tái)	內(nèi)分泌系統(tǒng)藥物藥效學(xué)評(píng)價(jià)
	生物膜片鉗藥物篩選平臺(tái)	抗炎免疫藥物藥效學(xué)評(píng)價(jià)
	常規(guī)藥物體外篩選

【本平臺(tái)合作項(xiàng)目】
分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、基因敲出/入、模式動(dòng)物、SPF動(dòng)物保種、病理學(xué)檢測(cè)、免疫學(xué)檢測(cè)、影像學(xué)檢測(cè)、原代培養(yǎng)、細(xì)胞藥篩、CRISPR/Cas9基因編輯、基因芯片、高通量測(cè)序、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)、高通量高內(nèi)涵篩選、藥效學(xué)評(píng)價(jià)、藥理毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)、慢病毒包裝與穩(wěn)轉(zhuǎn)株建立、SiRNA與納米載藥、ChIP、CO-IP、生物信息學(xué)分析、知識(shí)產(chǎn)權(quán)服務(wù)！
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