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威斯騰生物經(jīng)過(guò)10多年的發(fā)展，獲得了上百種細(xì)胞株和四十余種原代細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)，并建立了龐大的細(xì)胞庫(kù)及原代培養(yǎng)資料庫(kù)。細(xì)胞平臺(tái)有資深實(shí)驗(yàn)員、規(guī)范的SOP操作文件，萬(wàn)級(jí)凈化細(xì)胞房，這些條件為保質(zhì)保量完成每個(gè)客戶的實(shí)驗(yàn)提供了保障。 同時(shí)，威斯騰生物結(jié)合多年原代及傳代細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合平臺(tái)已有的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，建立了完善的體外藥篩實(shí)驗(yàn)，并引進(jìn)RTCA(Real-time cellular Analysis，實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞記錄儀），在藥篩過(guò)程中，全程實(shí)時(shí)記錄細(xì)胞真實(shí)狀況，為藥篩提供最真實(shí)精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

無(wú)菌操作注意事項(xiàng)

細(xì)胞培養(yǎng)一定要保持工作區(qū)的無(wú)菌清潔，先用紫外燈和臭氧殺菌1h，然后通風(fēng)30min，操作前需要換細(xì)胞間專(zhuān)用拖鞋，雙手帶上一次性橡膠手套并用75%乙醇消毒，穿上實(shí)驗(yàn)服，戴上一次性口罩和帽子，操作時(shí)不能大聲說(shuō)話，整個(gè)無(wú)菌操作都應(yīng)該在酒精燈的周?chē)M(jìn)行。

牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞

（1）取成牛眼球，75%酒精消毒，取出周?chē)嘤嘟M織，用PBS洗3次，用PBS流水沖洗眼球3次。

（2）沿角膜緣剪開(kāi)眼球，棄掉角膜、晶體、玻璃體等部分，將眼球后半部翻轉(zhuǎn)取出視網(wǎng)膜，將其剪碎平皿內(nèi)加入適量0.25%的胰酶，在37℃培養(yǎng)箱中，采用分次消化，每次消化20min約8次。

（3）每次消化后取上清液，并加入等量的含10%的DMEM培養(yǎng)基，輕輕混勻，中和胰酶的消化，防止消化過(guò)度。用200目細(xì)胞過(guò)濾篩子過(guò)濾含細(xì)胞的混合液，最后將過(guò)濾后的細(xì)胞懸液1000rpm離心5min。離心后收集沉淀，用PBS再次重復(fù)離心3次。用細(xì)胞培養(yǎng)基將細(xì)胞沉淀重懸，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，并每日觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)，接種后約4d后有少量細(xì)胞貼壁。

小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離

1.C57小鼠頸椎脫臼處死后浸泡于75%乙醇中消毒3~5 min后斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開(kāi)顱腔后取出全腦置于盛有冷D-Hanks'液的玻璃培養(yǎng)皿中解剖去除小腦、間腦(包括海馬)。

2. 隨后將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動(dòng)以吸除軟腦膜及腦膜大血管后置于新的含冷D-Hanks'液玻璃培養(yǎng)皿中，用細(xì)解剖鑷去除大腦白質(zhì)、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質(zhì)。
3. 用D-Hanks'液漂洗3次后，加入1 ml DMEM培養(yǎng)液，用虹膜剪將其剪碎成1 mm3大小，加入0.1%Ⅱ型膠原酶(含30 U/ml DNase I，1 ml/大腦)混勻后37 ℃水浴消化1.5 h。
4. 離心(1 000 rpm，5 min，室溫)，去上清液，加入20% BSA懸浮混勻后離心(1000 g，20 min，4 ℃)，去除中上層神經(jīng)組織及大血管，保留底部沉淀。
5. 加入3 ml 2.5%胰酶消化液消化20min，加入等量含血清培養(yǎng)基終止消化，離心(1 000 rpm，8 min，室溫)，去上清液，加入2 ml DMEM培養(yǎng)液懸浮后鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12 ml 50% Percoll(25 000 g，60 min，4 ℃)。
6. 離心(1 000 g，10 min，4 ℃)，靠近底部的紅細(xì)胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后用DMEM漂洗兩次(離心1 000 rpm，5 min，室溫)，去上清液。
7. 加入DMEM完全培養(yǎng)液(含20% FBS)懸浮后接種于涂布基質(zhì)的35 mm一次性塑料培養(yǎng)皿(1.5 ml/培養(yǎng)皿，可接種1個(gè)培養(yǎng)皿/大腦)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，12~24 h后換液，并加入1 ng/ml bFGF，隨后隔天換液。

細(xì)胞形態(tài)

腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)過(guò)程中，約24h即可貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形生長(zhǎng)緩慢。換液后細(xì)胞增殖明顯，出現(xiàn)以梭形為主的多種形態(tài)，5- 7d 70%-80%可融合達(dá)到傳代標(biāo)準(zhǔn)。

威斯騰實(shí)驗(yàn)服務(wù)流程

威斯騰生物服務(wù)項(xiàng)目

【本平臺(tái)合作項(xiàng)目】
分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、基因敲出/入、模式動(dòng)物、SPF動(dòng)物保種、病理學(xué)檢測(cè)、免疫學(xué)檢測(cè)、影像學(xué)檢測(cè)、原代培養(yǎng)、細(xì)胞藥篩、CRISPR/Cas9基因編輯、基因芯片、高通量測(cè)序、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)、高通量高內(nèi)涵篩選、藥效學(xué)評(píng)價(jià)、藥理毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)、慢病毒包裝與穩(wěn)轉(zhuǎn)株建立、SiRNA與納米載藥、ChIP、CO-IP、生物信息學(xué)分析、知識(shí)產(chǎn)權(quán)服務(wù)！
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