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技術(shù)原理：

CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）最新出現(xiàn)的一種由RNA指導(dǎo)Cas核酸酶對(duì)靶向基因進(jìn)行特定DNA修飾的技術(shù)。CRISPR是細(xì)菌和古細(xì)菌為應(yīng)對(duì)病毒和質(zhì)粒不斷攻擊而演化來(lái)的獲得性免疫防御機(jī)制。在這一系統(tǒng)中，crRNA（CRISPR-derived RNA）通過(guò)堿基配對(duì)與tracrRNA（trans-activating RNA）結(jié)合形成雙鏈RNA，此tracrRNA/crRNA二元復(fù)合體指導(dǎo)Cas9蛋白在crRNA引導(dǎo)序列靶定位點(diǎn)剪切雙鏈DNA達(dá)到對(duì)基因組DNA進(jìn)行修飾的目的。CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠?qū)π∈蠛痛笫蠡蚪M特定基因位點(diǎn)進(jìn)行精確編輯， 目前已經(jīng)成功應(yīng)用于大、小鼠基因KO/KI的模型制備。

技術(shù)特點(diǎn)：

（1）無(wú)物種限制

（2）靶向精確性更高

（3）可實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)敲除

（4）基因調(diào)控方式多種多樣

（5）修飾效率高，實(shí)驗(yàn)周期短

通過(guò)CRISPR /Cas9基因敲除技術(shù)，針對(duì)靶基因設(shè)計(jì)和構(gòu)建gRNA與Cas9表達(dá)質(zhì)粒，造成目的基因的功能區(qū)域被敲除，獲得全身所有的組織和細(xì)胞中都不表達(dá)該基因的小鼠模型 。

移碼突變鼠的建系原則與流程

1、通過(guò)針對(duì)靶基因設(shè)計(jì)、構(gòu)建相應(yīng)的gRNA質(zhì)粒，體外轉(zhuǎn)錄為RNA后，與Cas9 mRNA一起原核顯微注射獲得測(cè)序鑒定陽(yáng)性的F0代雜合子鼠；

2、F0代雜合子鼠與野生型鼠進(jìn)行交配，獲得PCR和測(cè)序鑒定陽(yáng)性的F1代雜合子鼠；

3、選擇來(lái)自同一只F0代鼠，基因型一致的F1代鼠，達(dá)到性成熟后進(jìn)行互配，可獲得F2代鼠。對(duì)獲得的F2代鼠進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定，理論上，F(xiàn)2代鼠中25%為純合子， 50%為雜合子，25%為野生鼠。

片段基因敲除鼠的建系原則與流程

1、通過(guò)針對(duì)靶基因不同位點(diǎn)設(shè)計(jì)、構(gòu)建相應(yīng)的一對(duì)gRNA質(zhì)粒，體外轉(zhuǎn)錄為RNA后，與Cas9 mRNA一起原核顯微注射獲得測(cè)序鑒定陽(yáng)性的F0代雜合子鼠；

2、F0代雜合子鼠與野生型鼠進(jìn)行交配，獲得PCR鑒定陽(yáng)性的F1代雜合子鼠；

3、選擇來(lái)自同一只F0代鼠，基因型一致的F1代鼠，達(dá)到性成熟后互配，可獲得F2代鼠。對(duì)獲得的F2代鼠進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定，理論上，F(xiàn)2代鼠中25%為純合子，50%為雜合子，25%為野生鼠。

雙（多）基因敲除鼠的建系原則與流程

1、通過(guò)針對(duì)兩個(gè)靶基因分別設(shè)計(jì)、構(gòu)建相應(yīng)的gRNA質(zhì)粒，體外轉(zhuǎn)錄為RNA后，與Cas9 mRNA一起原核顯微注射獲得測(cè)序鑒定陽(yáng)性的F0代多基因雜合子鼠；

2、F0代雜合子鼠與野生型鼠進(jìn)行交配，獲得PCR和測(cè)序鑒定陽(yáng)性的F1代雙基因雜合子鼠；

3、選擇雙基因雜合子鼠進(jìn)行雜交，獲得F2代鼠。對(duì)獲得的F2代鼠進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定。

威斯騰實(shí)驗(yàn)服務(wù)流程

威斯騰生物服務(wù)項(xiàng)目

【本平臺(tái)合作項(xiàng)目】
分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、基因敲出/入、模式動(dòng)物、SPF動(dòng)物保種、病理學(xué)檢測(cè)、免疫學(xué)檢測(cè)、影像學(xué)檢測(cè)、原代培養(yǎng)、細(xì)胞藥篩、CRISPR/Cas9基因編輯、基因芯片、高通量測(cè)序、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)、高通量高內(nèi)涵篩選、藥效學(xué)評(píng)價(jià)、藥理毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)、慢病毒包裝與穩(wěn)轉(zhuǎn)株建立、SiRNA與納米載藥、ChIP、CO-IP、生物信息學(xué)分析、知識(shí)產(chǎn)權(quán)服務(wù)！
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