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威斯騰生物經(jīng)過10多年的發(fā)展，獲得了上百種細(xì)胞株和四十余種原代細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)，并建立了龐大的細(xì)胞庫及原代培養(yǎng)資料庫。細(xì)胞平臺(tái)有資深實(shí)驗(yàn)員、規(guī)范的SOP操作文件，萬級(jí)凈化細(xì)胞房，這些條件為保質(zhì)保量完成每個(gè)客戶的實(shí)驗(yàn)提供了保障。 同時(shí)，威斯騰生物結(jié)合多年原代及傳代細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合平臺(tái)已有的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，建立了完善的體外藥篩實(shí)驗(yàn)，并引進(jìn)RTCA(Real-time cellular Analysis，實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞記錄儀），在藥篩過程中，全程實(shí)時(shí)記錄細(xì)胞真實(shí)狀況，為藥篩提供最真實(shí)精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離

操作方法

（1）取SD大鼠（2周齡），頸椎脫臼法處死后立即用75%乙醇浸泡，移入超凈工作臺(tái)內(nèi)，用大頭針固定大鼠四肢于工作臺(tái)面的泡沫板上。

（2）碘酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，無菌條件下用滅菌消毒后的鑷子和剪刀分離出大鼠股骨和脛骨，剔除骨頭表面肌肉，PBS溶液沖洗兩遍。

（3）從中間剪斷股骨和脛骨，用2ml無菌注射器吸取DMEM/F12溶液沖出骨髓細(xì)胞多次，再用針頭吹打，吸管吸入離心管內(nèi)，1000r/min離心5min，棄上清，用PBS重懸細(xì)胞。

（4）緩慢將細(xì)胞懸液加入預(yù)先裝有5mL淋巴細(xì)胞分離液的15mL離心管內(nèi)，保持細(xì)胞懸液在淋巴細(xì)胞分離液上層，注意不要攪動(dòng)液面，保持二者分層界面。

（5）2000rpm離心15-25min，離心后溶液分4層，吸取中間骨髓基質(zhì)細(xì)胞層（白色渾濁狀），PBS洗三次。

（6）用含15%胎牛血清及青鏈霉素的DMEM/F12以106/mL的細(xì)胞濃度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（7）24小時(shí)后棄去培養(yǎng)液（看細(xì)胞貼壁情況），PBS沖洗 2-3次去除未貼壁細(xì)胞，加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。以后每3d半量換液1次，一般10d細(xì)胞生長(zhǎng)融合。

（8）經(jīng)0.25%胰酶消化，1：2傳代，其后一般3-5d傳代1次，選取生長(zhǎng)良好的第三代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞形態(tài)

骨髓間充質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)過程中，約24小時(shí)即可出現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈圓形、梭形、三角形生長(zhǎng)緩慢。換液后細(xì)胞增殖明顯，出現(xiàn)以梭形為主的多種形態(tài)，10-14天70%-80%可融合達(dá)到傳代標(biāo)準(zhǔn)。傳代細(xì)胞形態(tài)單一，呈梭形或扁平型，增殖至細(xì)胞融合時(shí)呈漩渦狀和放射狀排列。

大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離

操作步驟

1. 取大鼠，使用7%水合氯醛（0.5ml/100g）麻醉，在無菌條件下迅速取出脂肪組織。
2. 用含１％青鏈雙抗的D-Hank’s 液沖洗3次。剝離脂肪組織上的血管。
3. 將脂肪組織剪碎，直到組織變?yōu)橐后w狀，加入8-10mL 胰酶，37℃消化90min。
4. 消化完成后，加入等量含血清DMEM 培養(yǎng)基終止消化，過200目篩網(wǎng)去除大塊組織。
5. 以1500r/min 離心5min，去上清液，加入含血清DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

6. 接種至６ 孔板，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃，CO2 濃度5％）。細(xì)胞穩(wěn)定培養(yǎng)24h后換液，沖去未貼壁的細(xì)胞，更換DMEM培養(yǎng)基（成分同上）繼續(xù)培養(yǎng)。以后每2天換液１ 次，注意觀察培養(yǎng)基有無渾濁、顏色變淡、漂浮物和絮狀物等

細(xì)胞形態(tài)

大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)過程中，約24h即可貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形生長(zhǎng)速度較慢。換液后細(xì)胞增殖明顯，出現(xiàn)以長(zhǎng)梭形為主的形態(tài)，5- 7d 70%-80%可融合達(dá)到傳代標(biāo)準(zhǔn)。傳代細(xì)胞形態(tài)單一，呈長(zhǎng)梭形。

牙源間充質(zhì)干細(xì)胞分離

操作步驟

（1）取SD乳大鼠，頸椎脫臼法處死后立即用75%乙醇浸泡，移入超凈工作臺(tái)內(nèi)，用大頭針固定大鼠四肢于工作臺(tái)面的泡沫板上。

（2）碘酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，無菌條件下用滅菌消毒后的鑷子和剪刀解剖出大鼠已萌的牙根發(fā)育中的第一磨牙，沿Hertwig上皮起始處橫切分離出包括根尖乳頭、Hertwig上皮、牙囊的根端復(fù)合體，PBS溶液沖洗兩遍。

（3）組織塊剪碎，然后采用酶消化法消化培養(yǎng)，單細(xì)胞懸液以1X105細(xì)胞/ml在加了15%胎牛血清及青鏈霉素的a-MEM培養(yǎng)基中，置37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

（4）24小時(shí)后棄去培養(yǎng)液（看細(xì)胞貼壁情況），PBS沖洗 2-3次去除未貼壁細(xì)胞，加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。以后每3d半量換液1次，一般10d細(xì)胞生長(zhǎng)融合。

（5）經(jīng)0.25%胰酶消化，1：2傳代，其后一般3-5d傳代1次，選取生長(zhǎng)良好的第三代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞形態(tài)

牙源間充質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)過程中，約24小時(shí)即可出現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈圓形、梭形、三角形生長(zhǎng)緩慢。換液后細(xì)胞增殖明顯，出現(xiàn)以梭形為主的多種形態(tài)，10-14天70%-80%可融合達(dá)到傳代標(biāo)準(zhǔn)。傳代細(xì)胞形態(tài)單一，呈梭形或扁平型，增殖至細(xì)胞融合時(shí)呈漩渦狀和放射狀排列。

威斯騰實(shí)驗(yàn)服務(wù)流程

威斯騰生物服務(wù)項(xiàng)目

【本平臺(tái)合作項(xiàng)目】

分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、基因敲出/入、模式動(dòng)物、SPF動(dòng)物保種、病理學(xué)檢測(cè)、免疫學(xué)檢測(cè)、影像學(xué)檢測(cè)、原代培養(yǎng)、細(xì)胞藥篩、CRISPR/Cas9基因編輯、基因芯片、高通量測(cè)序、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)、高通量高內(nèi)涵篩選、藥效學(xué)評(píng)價(jià)、藥理毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)、慢病毒包裝與穩(wěn)轉(zhuǎn)株建立、SiRNA與納米載藥、ChIP、CO-IP、生物信息學(xué)分析、知識(shí)產(chǎn)權(quán)服務(wù)！

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