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NDETM3000轉(zhuǎn)染試劑

產(chǎn)品介紹：

NDETM3000轉(zhuǎn)染試劑是威斯騰生物研發(fā)的一款新型陽離子聚合物（非脂質(zhì)體）轉(zhuǎn)染試劑。NDETM3000帶有更高的正電荷，能夠高效壓縮DNA/RNA，將DNA/RNA包裹在聚合物的內(nèi)部，通過細胞自身的胞吞作用，進入細胞內(nèi)吞體中，然后通過吸收內(nèi)吞體中的H+，改變其PH值，使內(nèi)吞體解體，將DNA/RNA釋放到細胞質(zhì)中，實現(xiàn)DNA/RNA的高效轉(zhuǎn)染。

產(chǎn)品特點：

NDETM3000轉(zhuǎn)染試劑具有以下特點：

——轉(zhuǎn)染效率高

——溫和低毒

——性價比高

——易于針對廣泛的細胞類型進行優(yōu)化

目前已驗證NDETM3000可以高效轉(zhuǎn)染(>80%)的哺乳動物細胞系有：HEK293、HeLa、CHO、COS；昆蟲細胞系有：Sf9和Sf21；對其他細胞系也有一定的轉(zhuǎn)染效率，包括某些原代細胞系，在優(yōu)化的條件下可實現(xiàn)40-60%的轉(zhuǎn)染效率。

此外，可以使用NDETM3000進行腺病毒、慢病毒和腺相關(guān)病毒高效包裝，其中慢病毒初始液滴度最高可達107TU/ml，經(jīng)超離或超濾濃縮后，最終滴度可達109TU/ml（病毒包裝優(yōu)化步驟可以登陸威斯騰生物官方網(wǎng)站查詢下載）。

貼壁細胞轉(zhuǎn)染步驟：

以6孔板培養(yǎng)體系為例，進行哺乳動物細胞系轉(zhuǎn)染。其他培養(yǎng)體系，參考表1調(diào)整。

1.轉(zhuǎn)染前一天，將細胞接種6孔板，使轉(zhuǎn)染時細胞匯合率達60—80%；

注意：細胞狀態(tài)對任何轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率都有著至關(guān)重要的影響，在轉(zhuǎn)染前，應(yīng)該觀察細胞狀態(tài)是否良好；對于剛復(fù)蘇的細胞，建議傳三代后再進行后續(xù)轉(zhuǎn)染實驗，以保證細胞處于旺盛生長期。

2.轉(zhuǎn)染前1-2h，更換2ml新鮮DMEM+5%FBS培養(yǎng)基；

注意：對于293系列易轉(zhuǎn)染的細胞系可以不換液；而要得到最優(yōu)化的轉(zhuǎn)染效果，建議使用2%-5%的血清可以得到更高的轉(zhuǎn)染效率。

3.向1.5ml無菌EP管中加入100μl Opti-MEM（或者其他無血清培養(yǎng)基），隨后吸取2μg質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至Opti-MEM中，輕輕混勻，室溫靜置5分鐘；

注意：Opti-MEM和質(zhì)粒從冰箱取出后，先讓其恢復(fù)至室溫，然后再進行轉(zhuǎn)染操作；質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染前請混合均勻。

4.取3～4μl NDE3000轉(zhuǎn)移至Opti-MEM中，輕輕混勻，室溫靜置15分鐘；

注意：NDE3000從冰箱取出后，先讓其恢復(fù)至室溫，然后再進行轉(zhuǎn)染操作；在轉(zhuǎn)染前請混合均勻。

5.靜置完畢，用槍頭輕輕來回吸打上一步混合液3次后，再轉(zhuǎn)移混合液至細胞培養(yǎng)基中，輕輕搖勻，將細胞放回37°C培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；

注意：來回吸打混合液可以更充分地分散NDE3000與質(zhì)粒DNA形成的復(fù)合物。

6.16-20h后，更換新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-72h后檢測基因表達。

注意：轉(zhuǎn)染24小時可以檢測到目的基因表達，但RNA和蛋白最高豐度表達分別出現(xiàn)在48小時和72小時。

Table .1 不同培養(yǎng)皿NDE^TM3000轉(zhuǎn)染試劑用量

懸浮細胞轉(zhuǎn)染步驟：

以250ml Shake flask（振蕩培養(yǎng)瓶）培養(yǎng)體系為例：

1.轉(zhuǎn)染前2小時，接種5.0*107細胞至250ml Shake flask；

注意：細胞狀態(tài)對任何轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率都有著至關(guān)重要的影響，在轉(zhuǎn)染前，應(yīng)該觀察細胞狀態(tài)是否良好；對于剛復(fù)蘇的細胞，建議傳三代后再進行后續(xù)轉(zhuǎn)染實驗，以保證細胞處于旺盛生長期。

2.向15ml 離心管中加入2.5ml Opti-MEM（或者其他無血清培養(yǎng)基），隨后吸取50μg質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至Opti-MEM中，輕輕混勻，室溫靜置5分鐘；

注意：Opti-MEM和質(zhì)粒從冰箱取出后，先讓其恢復(fù)至室溫，然后再進行轉(zhuǎn)染操作；質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染前請混合均勻。

3.取100μl NED3000轉(zhuǎn)移至Opti-MEM中，輕輕混勻，室溫靜置15分鐘；

注意：NED3000從冰箱取出后，先讓其恢復(fù)至室溫，然后再進行轉(zhuǎn)染操作；在轉(zhuǎn)染前請混合均勻。

4.用槍頭輕輕來回吸打上一步混合液3次后，再轉(zhuǎn)移混合液至細胞培養(yǎng)基中，輕輕搖勻，將細胞放回37度培養(yǎng)箱中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2～3小時。

5.添加25ml新鮮完全培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)36-72h后檢測基因表達。

注意：轉(zhuǎn)染24小時可以檢測到目的基因表達，但RNA和蛋白最高豐度表達分別出現(xiàn)在48小時和72小時。